引言
除前述DNA基礎上的分子檢測外，還可通過RNA或蛋白的方式對相關分子進行檢測。不同方法各有優缺點。此外，面對諸多方法，如何選擇適合臨床、適合自己單位實際情況的相關檢測并讓患者有最大獲益，更是考驗著病理醫師的智慧。
【關鍵詞】：分子診斷，預分析方法，二代測序（NGS），聚合酶鏈反應
【提要】
分析前注意事項，包括樣本采集、儲存和運輸，以及樣本評估，對于確保分子診斷測試的成功至關重要。
建議對小樣本進行組織分類和最大化分子分析材料
分子方法，例如基于測序、基于雜交或聚合酶鏈
基于反應的具有不同的敏感性和特異性，適當的使用取決于應用
設計分子檢測菜單需要考慮生物標志物、患病率、樣本類型、和測試方法的局限性。
RNA基礎上的檢測方法
RNA的檢測，首先是通過逆轉錄步驟將RNA轉化為互補DNA（complementary DNA，cDNA）；然后通過前述檢測DNA的方法進行分析。針對RNA的檢測方法在檢測融合及剪切變異時尤其有用。對于融合基因來說，RNA檢測方法去除了內含子序列，因此檢測更有效。此外，對RNA的檢測可以直接確定最終轉錄是否在框內（in-frame）。對于剪切變異來說，DNA檢測方法可以預測剪切事件；但檢測RNA可明確到底是否發生了這樣的剪切事件。RNA檢測方法還可用于評估靶基因的相對表達水平，這一般是在微陣列或NGS檢測平臺中進行的。
蛋白基礎上的檢測方法
臨床工作中，首選免疫組化檢測蛋白，且可用于某些潛在分子生物學改變的標記。針對特異性突變蛋白的定性免疫組化可迅速檢出潛在的DNA水平突變事件，如BRAF p.V600E、IDH1 p.R132H。免疫組化也可用于定量檢測，高密度著色可用于基因融合的替代性標記（如肺癌中的ALK）、或基因擴增的替代性標記（如乳腺癌中的ERBB2）。根據具體臨床情況，這類免疫組化指標可用于提示進一步行其他檢查、或本身即可做出明確診斷。
分子檢測方法涉及的分子包括DNA、RNA、蛋白，相關方法可檢測序列改變、結構變化、拷貝數改變、核酸的共價修飾及蛋白的改變。具體可根據檢測的分子類型、或被檢測改變的類型進行分類，詳見表1。
表1. 分子檢測方法及相應特點概述
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檢測方法 |
突變 |
融合 |
拷貝數改變 |
優點 |
局限性 |
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測序法 |
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檢測已知、特殊的改變 |
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Sanger測序 |
+ |
+/- |
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快速，價廉，所需DNA數量低 |
單基因，不是特別敏感（檢測下限10%-20%） |
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二代測序 |
+ |
+ |
+ |
多基因，檢測所有變異，可能極為敏感（0.001%） |
速度慢，價格高，所需DNA數量較多 |
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雜交及其他方法 |
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FISH |
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+ |
+ |
快速，廉價，單細胞 |
僅檢測已知/靶向變異，多基因方面受限 |
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序列分析 |
± |
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+ |
全基因組評估，高通量 |
可能無法檢出易位 |
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核型分析 |
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+ |
+ |
全基因組評估，單細胞 |
低通量（10MB），速度慢，人工 |
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免疫組化 |
+ |
+ |
± |
快速，單細胞 |
僅適用于融合及拷貝數改變的情況 |
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PCR法 |
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快速，價廉 |
僅檢測已知編譯；多基因方面受限 |
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定量PCR |
+ |
+ |
+ |
敏感性0.01% |
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等位基因特異性PCR |
+ |
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數字液滴PCR |
+ |
+ |
+ |
敏感性0.01% |
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設計分子檢測項目
分子診斷可為患者診療提供重要信息，比如協助診斷、改善對預后的預測能力、指導治療方案，尤其對于精準用藥特別關鍵。實際工作中，具體檢測的指標需綜合考慮臨床應用、技術條件、性價比。具體來說，需征求相關專家（如病理醫師、腫瘤醫師、遺傳學醫師等）的意見并遵循專業學會的指南。有些標記物可能有多種檢測方法，如IDH1突變的檢測方法有免疫組化、RTPCR、ddPCR、Sanger測序、NGS。對于膠質瘤的診斷來說，可首選免疫組化；但對于確定急性髓系白血病是否適用IDH1抑制劑來說，可能最好選擇PCR或測序的方法。
檢測所需時間及性價比也要考慮到，因為這會影響到具體指標的選擇、以及判斷是否必須進行這一檢測。比如肺癌，目前推薦多項標記物的檢測，但根據具體方法，是單一指標進行檢測、還是同時進行多項檢測，要綜合考慮所需時間及費用。有些實驗室采取的是依次分別進行檢測。相關指標如果不能全選，則更常見選擇KRAS或EGFR突變，而不是ALK、RET、ROS1融合；如果分別各項檢測，且臨床情況允許，可考慮先進行KRAS或EGFR突變的DNA檢測，然后在結果陰性的時候進行ALK、RET或ROS1的RNA檢測。其他某些情況下，選擇更為迅速的rtPC可能更為合適，比如轉移性肺癌患者需迅速得到治療時。
如果檢測的是有多種檢測方法、且不同腫瘤中陽性率不一的廣譜腫瘤標記物，則檢測方案的選擇會很麻煩。具體如NTRK基因融合的檢測：該基因融合具有相應靶向治療方案，但不同腫瘤中的陽性率可低至5%、高達75%以上。從實用觀點來說，很多實驗室選擇一個方案解決所有問題會很困難。這種情況下建議多種檢測方案聯合應用，如FISH檢測NTRK融合幾率高的腫瘤、免疫組化用于一般不會表達TRK且NTRK基因融合幾率低的腫瘤，NGS方案用于免疫組化表達TRK、或其他檢查為陰性情況下的檢測。
確定了要檢測的指標及具體檢測方案后，實驗室具體可采取FDA批準（approved）或FDA許可（cleared）的方法、或選擇實驗室所建立（laboratory-developed）的檢測方法。FNA批準或許可的方法，是體外診斷（in-vitro diagnostics，IVD）試劑商生產且FDA批準或許可用于臨床診斷的；實驗室建立的方法可用檢測套裝、僅供研究的試劑、僅供特定分析的試劑、和/或通用試劑等進行檢測。FDA批準或許可的方法在應用前必須進行驗證，而實驗室建立的方法也必須驗證，以確定相關檢測的性能特點。檢測驗證必須包括準確性、精確性、可檢測范圍、參考值、敏感性、特異性方面的評估。對于相關檢測來說，關鍵是有恰當的校準、參考物、對照標本。
除了建立實驗室內部的生物標記物檢測外，還可考慮制定送至中心實驗室的相關檢測方案，如常見病的常見標記物在本實驗室進行檢測，而較罕見的標記物則送至中心實驗室。這樣可以讓較小的實驗室流程優化，取得較好的性價比。
總之，設計一個分子診斷清單可能是一項復雜的任務，但詳盡規劃、相互合作，可以制定出一個適合大部分情況、兼顧不同方案優缺點的分子診斷方案。
全文完
參考文獻
Ewalt MD, Hsiao SJ. Molecular Methods: Clinical Utilization and Designing a Test Menu. Surg Pathol Clin. 2021;14(3):359-368.
doi:10.1016/j.path.2021.05.001