引言

顧名思義，分子診斷主要是通過多種方法來評估相關分子、進而分析送檢標本中的遺傳學改變。作為分子診斷的執行者，病理醫師應了解分子檢測方法并掌握其優缺點，以更有針對性的將其用于實際工作。根據《Surg Pathol Clin》雜志2021年刊發的分子病理系列文章，我們將為大家編譯介紹最常用的分子檢測方法，本期請看DNA基礎上的檢測方案。

【關鍵詞】：分子診斷，預分析方法，二代測序（NGS），聚合酶鏈反應

【提要】
分析前注意事項，包括樣本采集、儲存和運輸，以及樣本評估，對于確保分子診斷測試的成功至關重要
建議對小樣本進行組織分類和最大化分子分析材料
分子方法，例如基于測序、基于雜交或聚合酶鏈
基于反應的具有不同的敏感性和特異性，適當的使用取決于應用
設計分子檢測菜單需要考慮生物標志物、患病率、樣本類型、和測試方法的局限性。

分子檢測方法涉及的分子包括DNA、RNA、蛋白，相關方法可檢測序列改變、結構變化、拷貝數改變、核酸的共價修飾及蛋白的改變。具體可根據檢測的分子類型、或被檢測改變的類型進行分類。就DNA基礎上的檢測來說，具體可分為測序法及非測序的相關方法。

DNA測序法

有多種方法可檢測DNA分子，具體可分為測序為主的方案和非測序為主的方案，前者評估靶向DNA分子的全部核苷酸序列。臨床常用的測序檢測主要有兩種，分別是Sanger測序和二代測序（next-generation sequencing，NGS）。

Sanger測序也稱為雙脫氧測序，是一種有效獲取DNA序列信息的方法。該方法是在有脫氧核苷酸（deoxynucleoside triphosphates，dNTPs）分子和雙脫氧核苷酸（dideoxynucleoside triphosphates，ddNTP）的情況下擴增DNA片段。ddNTP整合入延長的DNA分子后，延長反應終止。終止點沿著DNA分子全長隨機出現且有重復，因此會有很多終止點相同的片段。然后將這些碎片按照大小分開，ddNTP含有對應于結合堿基（A、T、C或G）的熒光標記，可以通過儀器檢出并與片段長度相結合。通過這種方法，就可以“讀”出特異性序列。

Sanger測序的優點在于耗時短，可以“讀”的序列長度要比NGS更長，且可以在檢測區域檢出單個核苷酸的變化、插入或缺失。不過，Sanger測序的敏感性有限，一般需樣本中至少有10%-20%的待測序列才可以。由于癌中很多序列具有異質性，因此需標本中的腫瘤細胞比例至少20%-40%才可以通過該方法準確檢出相關改變。此外，Sanger測序的分子是大量“閱讀”所得（即所有大小相同的片段同時解讀），因此可能很難確定、或無法確定同一Sanger測序的同一DNA條帶中、或不同DNA條帶中存在多種變異。

最近幾年，臨床腫瘤實驗室已廣泛應用NGS，該方法又稱為大規模平行測序（massively parallel sequencing）。盡管不同的NGS平臺所用方法及試劑有所不同，但其基本原則是相似的。NGS的第一步稱為文庫構建（library generation）和靶向富集（target enrichment）。

NGS的優勢在于敏感性極高，如果采用唯一分子標識符（unique molecular identifiers，UMIs）的方法，可檢出1%以下的目標DNA序列。此外，如果相關變異在同一被測分子中極為接近，這一方法可以評估相關突變是在同一DNA條帶、還是在不同DNA條帶。NGS還可同時分析多個靶向區域，而Sanger測序僅可檢測單一區域。不過，NGS相比Sanger測序來說，需要較多的DNA、所需時間較長、單次檢測費用更高。需要注意的是，盡管單次Sanger測序反應更快、費用更低，但對于每個堿基的費用來說，取決于靶向區域的大小，因此NGS可能性價比更高。

非DNA測序法

針對DNA的遺傳學檢測還有非DNA測序的方法，如雜交、核型分析、PCR基礎上的方法等。

雜交法的檢測中，熒光標記的短DNA序列（即所謂的探針）與特異性靶點互補，可與特異性DNA靶點結合或雜交。這一熒光原位雜交檢測方法中，這類探針有多種應用：可以通過和對照信號中（如ERBB2或CNE17）熒光信號的數量進行比較來計算拷貝數改變；可以在靶點區域兩端標記不同顏色來證實某一基因的斷裂（如MYC斷裂），或在配體基因標記不同顏色、通過尋找重疊信號來確定融合基因的融合配體（如BCR-ABL1融合）。熒光原位雜交對于所靶向的特異性改變來說，快速且高敏，但部分變異的改變可能會漏診（尤其小于熒光原位雜交探針大小的情況下、或某些特殊改變），且每一次檢測僅可檢測極少數靶點。

染色體微陣列（chromosomal microarray，CMA）是通過每一種可能等位基因的探針、在基因組內千千萬萬個單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）中進行檢測。每一個位置的每一種探針熒光信號確定SNP的基因型，并確定患者的每一個位置是純合型、還是雜合型。通過對整個基因組的觀察，還可以在極高分辨率水平上（15kb）得出拷貝數改變的信息，且可以獲得單個位點的基因型特異信息。CMA在極高分辨率水平上對全基因組進行評估，但由于所用是短探針，一般無法檢出平衡易位，因為大量DNA存在時平衡易位并無基因組凈值變化。

核型分析是評估基因組改變的最成熟方案，且在一次檢測中觀察全部基因組。該方法是將活細胞進行培養，使其同步化并停止在細胞周期的分裂間期。然后在玻片表面將細胞輕輕的裂解并染色（一般是Giemsa染色），以獲取染色體的條帶。每一條染色體都有獨特的條帶分布，有經驗的技師及遺傳學專家可以通過解讀這些條帶分布來描述整個基因組的結構改變、拷貝數改。這一方法耗時3-7天，具體取決于培養細胞的生長速度；且該方法的分辨率低，一般可見的染色體條帶對應10Mb大小DNA。

PCR基礎上的檢測方法有多種，是通過PCR反應的特異性來檢測相關改變。最簡單的是有突變序列存在時的等位基因特異性擴增方法獲取PCR產物，無靶向突變等位基因則無法擴增。還可以通過設計引物來擴增特異性易位，但這一做法更多見于RNA模板檢測。PCR的一種定量方法是數字PCR（digital PCR，dPCR），其模板DNA稀釋并分割為無模板分子（0）或一個模板分子（1），因此而得名“數字”。臨床實驗室更常見的是數字液滴PCR（digital droplet PCR，ddPCR），該方法中，模板DNA稀釋并乳化至不含（即0）或含一個（即1）模板DNA分子的液滴。然后針對特異基因型進行PCR反應。定量化的報告，可以是每單位容積內特殊基因型液滴的數量，也可以是含DNA液滴的總數（及變異型與正常之和）。PCR檢測方法快速、且價格相對低廉，同時對于檢測的變異來說敏感性高：實時熒光定量PCR及ddPCR可檢出萬分之一至十萬分之一的變異，常規用于微小或可測量病變的檢測及ctDNA評估。盡管有上述優點，但PCR的方法僅可用于評估已知變異，且多路檢測的能力有限，因此一次反應僅能針對4-8個靶向變異。

此前所述的DNA檢測方案是針對特異性DNA序列、結構或拷貝數；現在甲基化的檢測方法可檢出胞嘧啶核苷酸中甲基的表觀共價結合。這些方法也是用可以裂解或不可裂解甲基的特異性限制酶、或者用亞硫酸氫鹽反應來轉化未甲基化的尿嘧啶堿基，然后再進行序列特異性檢測（如PCR或測序）而確定特異性堿基的甲基化情況。

未完待續

參考文獻

Ewalt MD, Hsiao SJ. Molecular Methods: Clinical Utilization and Designing a Test Menu. Surg Pathol Clin. 2021;14(3):359-368.

doi:10.1016/j.path.2021.05.001