作為病理醫(yī)師，了解并掌握分子病理相關(guān)要求已迫在眉睫

不管我們是否情愿，分子病理在診斷領(lǐng)域的攻城略地已是不爭(zhēng)的事實(shí)。一方面，其應(yīng)用范圍已擴(kuò)展至諸多不同的瘤種；另一方面其應(yīng)用遍及疾病診斷、預(yù)后判斷、治療方案的制定。因此，作為病理醫(yī)師，了解并掌握分子病理相關(guān)要求已迫在眉睫。2021年，《Surg Pathol Clin》雜志曾組織刊發(fā)了一系列分子病理的文章。為幫助大家系統(tǒng)的了解相關(guān)問題，我們公眾號(hào)將逐步編譯介紹這些內(nèi)容。

分子診斷主要著眼于通過多種方法來評(píng)估諸多分子，進(jìn)而分析送檢標(biāo)本中的遺傳學(xué)改變

本次編譯文章將詳述具體實(shí)踐中的相關(guān)注意事項(xiàng)。

檢測(cè)前注意事項(xiàng)

標(biāo)本收集、轉(zhuǎn)移及儲(chǔ)存都是確保標(biāo)本可以進(jìn)行分子檢測(cè)、不會(huì)出現(xiàn)假陰性的重要因素。分子診斷常用標(biāo)本有福爾馬林固定石蠟包埋的組織、細(xì)胞塊、涂片、血液、骨髓抽吸標(biāo)本、新鮮或冰凍組織。血液及骨髓標(biāo)本一般收集在EDTA管或檸檬酸鹽管中。這類供分子檢測(cè)的標(biāo)本一般不建議用其他收集管，如含肝素的試管，因?yàn)楦嗡乜梢杂绊懞怂岢樘帷⒑?/span>/或抑制PCR擴(kuò)增。其他檢測(cè)可能需要特殊的試管，如RNA相關(guān)檢測(cè)需要用加入RNA穩(wěn)定劑的采血管，循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）常用加入了有核細(xì)胞穩(wěn)定劑的采血管。福爾馬林固定石蠟包埋標(biāo)本中，則在標(biāo)本收集、固定、儲(chǔ)存等方面有諸多因素可影響由此抽提的DNA或RNA的質(zhì)和量。分子檢測(cè)標(biāo)本中關(guān)鍵的檢測(cè)前因素，可參見表1。

表1. 分子檢測(cè)的檢測(cè)前注意事項(xiàng)

1. 標(biāo)本收集

標(biāo)本收集至標(biāo)本固定的時(shí)間，稱為缺血時(shí)間。研究發(fā)現(xiàn)，缺血時(shí)間對(duì)DNA的數(shù)量及質(zhì)量無顯著影響。不過對(duì)于RNA相關(guān)檢測(cè)來說，由于RNA穩(wěn)定性方面的問題，缺血時(shí)間會(huì)顯著影響檢測(cè)。尤其基因表達(dá)的相關(guān)檢測(cè)對(duì)這一因素的影響非常敏感，因此應(yīng)盡可能的縮短缺血時(shí)間。

2. 組織固定

病理日常工作中，標(biāo)準(zhǔn)的固定液是10%中性緩沖福爾馬林，通過交聯(lián)DNA及蛋白而保存組織。其他固定液如B5、Bouin、Zenker等，可誘導(dǎo)金屬-蛋白復(fù)合物形成或脫嘌呤，因此如果后續(xù)要做分子檢測(cè)，則不推薦應(yīng)用。

固定的時(shí)間也會(huì)影響核酸的質(zhì)量。用10%的中性緩沖福爾馬林時(shí)，已有報(bào)道稱過度固定（時(shí)長(zhǎng)超過72小時(shí)）可影響DNA的數(shù)量及質(zhì)量。包括酒精固定的細(xì)胞涂片及細(xì)胞塊等細(xì)胞學(xué)標(biāo)本也可得到高質(zhì)量的核酸并可用于分子檢測(cè)。

3. 脫鈣

目前有多種脫鈣劑，但很多都含有酸，可破壞DNA并導(dǎo)致脫嘌呤。因此脫鈣的過程可能會(huì)導(dǎo)致標(biāo)本不適于分子檢測(cè)，因此應(yīng)盡可能避免。也有些脫鈣劑不會(huì)破壞DNA，如EDTA，因此可用于分子檢測(cè)。由于難以預(yù)料后續(xù)是否需進(jìn)行分子檢測(cè)，因此不建議用含酸的脫鈣液對(duì)全部標(biāo)本進(jìn)行處理；相反，應(yīng)有一個(gè)組織塊用EDTA脫鈣、并在報(bào)告中記錄，以備后續(xù)的分子檢測(cè)所需。

EDTA脫鈣所用濃度是10%至20%，一般為14%，且與pH有關(guān)。活檢標(biāo)本的大小會(huì)影響脫鈣效率，小標(biāo)本需16-24小時(shí)，較大標(biāo)本可能需數(shù)天。其他影響脫鈣速度的因素還有溫度、攪動(dòng)的情況、容器的大小等，EDTA溶液與標(biāo)本的體積比一般為20:1，且應(yīng)定期更換。

4. 標(biāo)本儲(chǔ)存及轉(zhuǎn)移

新鮮組織或體液，應(yīng)立即送至實(shí)驗(yàn)室并盡可能快的做出處理，尤其需要RNA類檢測(cè)時(shí)。加入穩(wěn)定劑后，溶解細(xì)胞并穩(wěn)定核酸酶，可以保存標(biāo)本一定時(shí)間后進(jìn)行核酸抽提。

另一個(gè)問題是標(biāo)本檢測(cè)循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）：如果ctDNA檢測(cè)的標(biāo)本收集在未加有核細(xì)胞穩(wěn)定劑的試管中，則應(yīng)在收集后6小時(shí)內(nèi)處理。標(biāo)本應(yīng)在質(zhì)控狀態(tài)下保存，以將降解控制在最低水平。在保護(hù)劑中長(zhǎng)期儲(chǔ)存會(huì)導(dǎo)致核酸的降解。與此類似，長(zhǎng)期保存的福爾馬林固定石蠟包埋組織也會(huì)有DNA的碎片化、胞嘧啶的脫氨基，且可導(dǎo)致DNA質(zhì)量欠佳從而擴(kuò)增失敗和/或序列假象（sequence artifacts）.

5. 標(biāo)本評(píng)估

對(duì)于體細(xì)胞檢測(cè)來說，必須評(píng)估送檢標(biāo)本中的腫瘤細(xì)胞含量。足夠比例的腫瘤細(xì)胞，是確保腫瘤內(nèi)相關(guān)變化在標(biāo)本分子檢測(cè)范圍之內(nèi)所必需。腫瘤細(xì)胞比例不足，可導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

腫瘤比例的評(píng)估一般是在HE切片中人工審核，但部分實(shí)驗(yàn)室也通過數(shù)字圖像分析來降低評(píng)估中的主觀性。Sanger測(cè)序需要腫瘤細(xì)胞比例20%-40%，其他高敏檢測(cè)所需腫瘤細(xì)胞比例可低至百分之幾。不過由于腫瘤比例估計(jì)的不精準(zhǔn)，因此常需進(jìn)行腫瘤富集、使其超出檢測(cè)所需最低比例；同時(shí)確保可以檢出亞克隆突變或腫瘤異質(zhì)性。具體常采用的方式有用手術(shù)刀等刮下腫瘤區(qū)域，或在顯微鏡下對(duì)切片中的小灶區(qū)域進(jìn)行顯微切割。激光顯微切割是另一種腫瘤富集方法，但其價(jià)格高、時(shí)間長(zhǎng)，限制了其廣泛應(yīng)用。

6. 分子檢測(cè)的組織分配

對(duì)于微創(chuàng)所得小標(biāo)本來說，確保保留足量組織用于診斷和后續(xù)分子檢測(cè)可能具有挑戰(zhàn)性。比如對(duì)于肺癌來說，建議進(jìn)行檢測(cè)的指標(biāo)有PD-L1、EGFR、ALK、ROS1、BRAF、KRAS、ERBB2、MET、RET、NTRK。這些指標(biāo)的檢測(cè)可通過多種方法的組合完成，具體如免疫組化、FISH、靶向PCR、DNA測(cè)序、和/或RNA測(cè)序，但每一種方法對(duì)組織都有最低量的要求。如果依次進(jìn)行檢測(cè)，則組織塊需要多次重修，標(biāo)本會(huì)迅速耗竭。盡可能保留標(biāo)本供檢測(cè)的方法有：每個(gè)穿刺芯單獨(dú)包埋，對(duì)組織塊進(jìn)行淺修，包括細(xì)胞學(xué)標(biāo)本在內(nèi)的所有可用標(biāo)本（如涂片、細(xì)針抽吸標(biāo)本、細(xì)胞塊）都可進(jìn)行檢測(cè)，用ctDNA進(jìn)行檢測(cè)。病理醫(yī)師應(yīng)與腫瘤醫(yī)師、外科醫(yī)師、介入醫(yī)師密切溝通，并結(jié)合組織學(xué)、免疫組化、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子檢測(cè)相關(guān)結(jié)果來恰當(dāng)分配標(biāo)本。

全文完

參考文獻(xiàn)

Ewalt MD, Hsiao SJ. Molecular Methods: Clinical Utilization and Designing a Test Menu. Surg Pathol Clin. 2021;14(3):359-368.

doi:10.1016/j.path.2021.05.001