作為病理醫(yī)師，了解并掌握分子病理相關要求已迫在眉睫

不管我們是否情愿，分子病理在診斷領域的攻城略地已是不爭的事實。一方面，其應用范圍已擴展至諸多不同的瘤種；另一方面其應用遍及疾病診斷、預后判斷、治療方案的制定。因此，作為病理醫(yī)師，了解并掌握分子病理相關要求已迫在眉睫。2021年，《Surg Pathol Clin》雜志曾組織刊發(fā)了一系列分子病理的文章。為幫助大家系統(tǒng)的了解相關問題，我們公眾號將逐步編譯介紹這些內容。

分子診斷主要著眼于通過多種方法來評估諸多分子，進而分析送檢標本中的遺傳學改變

本次編譯文章將詳述具體實踐中的相關注意事項。

檢測前注意事項

標本收集、轉移及儲存都是確保標本可以進行分子檢測、不會出現(xiàn)假陰性的重要因素。分子診斷常用標本有福爾馬林固定石蠟包埋的組織、細胞塊、涂片、血液、骨髓抽吸標本、新鮮或冰凍組織。血液及骨髓標本一般收集在EDTA管或檸檬酸鹽管中。這類供分子檢測的標本一般不建議用其他收集管，如含肝素的試管，因為肝素可以影響核酸抽提、和/或抑制PCR擴增。其他檢測可能需要特殊的試管，如RNA相關檢測需要用加入RNA穩(wěn)定劑的采血管，循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）常用加入了有核細胞穩(wěn)定劑的采血管。福爾馬林固定石蠟包埋標本中，則在標本收集、固定、儲存等方面有諸多因素可影響由此抽提的DNA或RNA的質和量。分子檢測標本中關鍵的檢測前因素，可參見表1。

表1. 分子檢測的檢測前注意事項

1. 標本收集

標本收集至標本固定的時間，稱為缺血時間。研究發(fā)現(xiàn)，缺血時間對DNA的數量及質量無顯著影響。不過對于RNA相關檢測來說，由于RNA穩(wěn)定性方面的問題，缺血時間會顯著影響檢測。尤其基因表達的相關檢測對這一因素的影響非常敏感，因此應盡可能的縮短缺血時間。

2. 組織固定

病理日常工作中，標準的固定液是10%中性緩沖福爾馬林，通過交聯(lián)DNA及蛋白而保存組織。其他固定液如B5、Bouin、Zenker等，可誘導金屬-蛋白復合物形成或脫嘌呤，因此如果后續(xù)要做分子檢測，則不推薦應用。

固定的時間也會影響核酸的質量。用10%的中性緩沖福爾馬林時，已有報道稱過度固定（時長超過72小時）可影響DNA的數量及質量。包括酒精固定的細胞涂片及細胞塊等細胞學標本也可得到高質量的核酸并可用于分子檢測。

3. 脫鈣

目前有多種脫鈣劑，但很多都含有酸，可破壞DNA并導致脫嘌呤。因此脫鈣的過程可能會導致標本不適于分子檢測，因此應盡可能避免。也有些脫鈣劑不會破壞DNA，如EDTA，因此可用于分子檢測。由于難以預料后續(xù)是否需進行分子檢測，因此不建議用含酸的脫鈣液對全部標本進行處理；相反，應有一個組織塊用EDTA脫鈣、并在報告中記錄，以備后續(xù)的分子檢測所需。

EDTA脫鈣所用濃度是10%至20%，一般為14%，且與pH有關。活檢標本的大小會影響脫鈣效率，小標本需16-24小時，較大標本可能需數天。其他影響脫鈣速度的因素還有溫度、攪動的情況、容器的大小等，EDTA溶液與標本的體積比一般為20:1，且應定期更換。

4. 標本儲存及轉移

新鮮組織或體液，應立即送至實驗室并盡可能快的做出處理，尤其需要RNA類檢測時。加入穩(wěn)定劑后，溶解細胞并穩(wěn)定核酸酶，可以保存標本一定時間后進行核酸抽提。

另一個問題是標本檢測循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）：如果ctDNA檢測的標本收集在未加有核細胞穩(wěn)定劑的試管中，則應在收集后6小時內處理。標本應在質控狀態(tài)下保存，以將降解控制在最低水平。在保護劑中長期儲存會導致核酸的降解。與此類似，長期保存的福爾馬林固定石蠟包埋組織也會有DNA的碎片化、胞嘧啶的脫氨基，且可導致DNA質量欠佳從而擴增失敗和/或序列假象（sequence artifacts）.

5. 標本評估

對于體細胞檢測來說，必須評估送檢標本中的腫瘤細胞含量。足夠比例的腫瘤細胞，是確保腫瘤內相關變化在標本分子檢測范圍之內所必需。腫瘤細胞比例不足，可導致假陰性結果。

腫瘤比例的評估一般是在HE切片中人工審核，但部分實驗室也通過數字圖像分析來降低評估中的主觀性。Sanger測序需要腫瘤細胞比例20%-40%，其他高敏檢測所需腫瘤細胞比例可低至百分之幾。不過由于腫瘤比例估計的不精準，因此常需進行腫瘤富集、使其超出檢測所需最低比例；同時確保可以檢出亞克隆突變或腫瘤異質性。具體常采用的方式有用手術刀等刮下腫瘤區(qū)域，或在顯微鏡下對切片中的小灶區(qū)域進行顯微切割。激光顯微切割是另一種腫瘤富集方法，但其價格高、時間長，限制了其廣泛應用。

6. 分子檢測的組織分配

對于微創(chuàng)所得小標本來說，確保保留足量組織用于診斷和后續(xù)分子檢測可能具有挑戰(zhàn)性。比如對于肺癌來說，建議進行檢測的指標有PD-L1、EGFR、ALK、ROS1、BRAF、KRAS、ERBB2、MET、RET、NTRK。這些指標的檢測可通過多種方法的組合完成，具體如免疫組化、FISH、靶向PCR、DNA測序、和/或RNA測序，但每一種方法對組織都有最低量的要求。如果依次進行檢測，則組織塊需要多次重修，標本會迅速耗竭。盡可能保留標本供檢測的方法有：每個穿刺芯單獨包埋，對組織塊進行淺修，包括細胞學標本在內的所有可用標本（如涂片、細針抽吸標本、細胞塊）都可進行檢測，用ctDNA進行檢測。病理醫(yī)師應與腫瘤醫(yī)師、外科醫(yī)師、介入醫(yī)師密切溝通，并結合組織學、免疫組化、細胞遺傳學、分子檢測相關結果來恰當分配標本。

全文完

參考文獻

Ewalt MD, Hsiao SJ. Molecular Methods: Clinical Utilization and Designing a Test Menu. Surg Pathol Clin. 2021;14(3):359-368.

doi:10.1016/j.path.2021.05.001